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    Die Erfindung betrifft ein neues Antibiotikum, HK110311129, mit dem Molekulargewicht 1113 und der Summenformel C¶56¶H¶75¶NO¶22¶, ein Verfahren zu dessen Herstellung unter Verwendung eines Mikroorganismus, Streptomyces spec. DSM 13059, und dessen Verwendung als antibakterielles Heilmittel mit besonderer Wirksamkeit gegen Infektionen mit grampositiven Bakterien, insbesondere mit Antibiotika-resistenten Keimen.
    公开号:DE102004010219A1
    申请号:DE102004010219
    申请日:2004-02-27
    公开日:2005-09-15
    发明作者:Friedrich Dr. Gollmick；Udo Prof. Dr. 07745 Jena Gräfe；Ingrid Dr. Groth；Kerstin Herold；Ute Dr. Möllmann；Martin Dr. Roth
    申请人:Hans-Knoll-Institut fur Naturstoff-Forschung Ev；KNOELL HANS FORSCHUNG EV；
    IPC主号:C07D309-10
    专利说明:
    [0001] Bekanntermaßen werdenErreger bakterieller Infektionskrankheiten unter dem Einfluß der Antibiotikatherapieunter Selektionsdruck resistent, u.a. auch beschleunigt durch zuhäufigeund falsche Anwendung von Antibiotika. Besondere Probleme bereitenzunehmend Infektionen, die durch mehrfach-resistente grampositiveBakterien, wie Staphylococcus aureus oder durch Glycopeptid-resistenteEnterokokken hervorgerufen werden, die, wie im Fall des Hospitalismus,bei immun-geschwächtenPatienten zu gefährlichenErkrankungen führenkönnen.Die bei diesen Keimen auftretenden Multiresistenzen, erschwerendie Behandlung aufgrund nicht mehr zur Verfügung stehender Therapeutika.Vancomycin (ein Glykopeptid) ist das Reserveantibiotikum gegen schwerwiegendeInfektionen mit multiresistenten Staphylokokken (MRSA). Die vanAdeterminierte Vancomycinresistenz trat bisher nur bei Enterokokken(VRE) auf, ohne das extreme Multiresistenzproblem wie bei MRSA.Der lange Zeit gefürchteteinterspezifische Transfer der vanA-Resistenz von Enterokokken aufStaphylokokken trat erstmals 2002 in den USA auf. Bei diesen Vancomycin-hochresistentenStaphylococcus aureus-Stämmenist das vanA Gen in ein Multiresistenzplasmid integriert (Gottlieb,S. BMJ 326; 783(2003)).
    [0002] DieseEntwicklungen und die teilweise unterschätzte Notwendigkeit der intensivenSuche nach neuen Strukturen und Targets führten zu einem Mangel an ausreichendwirksamen Therapeutika. Um die Heilung bakterieller Erkrankungenzu sichern und Infektionen mit Antibiotika-Resistenzen behandelnzu können,sind dringend neue antibiotisch wirksame Substanzen erforderlich(siehe z.B. Gräfe,Biochemie der Antibiotika, Spektrum Heidelberg 1992; S. Grabley,R. Thiericke & U.Gräfe,Drug Discovery from Nature, Springer, S. 281-301, 1999). Vor diesemHintergrund gewinnen neue Antibiotika, welche die beschriebenenResistenzbarrieren überwindenkönnen,enorm an Bedeutung. Darüberhinaussollten andere Nachteile, wie ungenügendes Wirkungsspektrum, ungünstige Pharmakokinetikund Nebenwirkungen der in Anwendung befindlichen Antibiotika überwundenwerden.
    [0003] Aufgabeder Erfindung ist es, einen neuen mikrobiellen Wirkstoff mit originellerStruktur und guten antimikrobiellen Eigenschaften, speziell gegenmultiresistente Keime, zur Verfügungzu stellen.
    [0004] DieseAufgabe wird erfindungsgemäß dadurchgelöst,daß derAktinomycetenstamm Streptomyces sp. HKI 0179 in einem flüssigen Nährmediummit Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie üblichen anorganischen Salzenfermentiert wird, bis sich der neue antimikrobielle Wirkstoff, nachfolgendHKI10311129 genannt, in der Kulturbrühe anhäuft und anschließend HKI10311129in reiner Form daraus isoliert werden kann. Der StreptomycesstammHKI 0179 wurde in der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)in Braunschweig, Mascheroder Wege 1, unter der Bezeichnung DSM 13059hinterlegt.
    [0005] HKI10311129unterscheidet sich von den bisher bekannten Antibiotika durch seinechemische Struktur, deren Neuheit durch physikochemische Messungenzweifelsfrei belegt wird (Tab. 1 und 2).
    [0006] Vonverwandten Strukturen, die in dem japanischen Patent 94 339 395,in CA 122, 237919g und in J. Antibiot., 45 (1992), 1974-6 beschriebenwurden, sind keine antimikrobiellen Wirkungen bekannt. Von einer weiterenverwandten Struktur, beschrieben in J. Antibiot. 51 (1998), 21-25,26-32 ist zwar eine Aktivitätgegen Methicillin resistente Staphylokokken bekannt, aber keineAktivitätgegen Enterokokken und besonders auch keine Aktivität gegenStämmemit vanA determinierter Vancomycin-Resistenz.
    [0007] Obwohlaus dem Streptomycesstamm DSM 13059 das Antibiotikum Altamiramycinschon bekannt ist ( DE 100 65606 ), wurde jetzt der neue antimikrobielle Wirkstoff HKI10311129entdeckt, der überraschenderweiseeine sehr starke antibakterielle Wirksamkeit gegen grampositiveBakterien besitzt, insbesondere gegen multiresistente Keime wieStaphylokokken und Enterokokken. HKI10311129 kann speziell als Heilmittelfür Infektionenmit multiresistenten grampositiven Keimen, einschließlich solchermit vanA determinierter Glykopeptidresistenz, bei Mensch und Tiereingesetzt werden.
    [0008] DieErfindung betrifft somit: 1. Eine Verbindungder Molmasse 1113, der Summenformel C56H75NO22, der Strukturformel:
    [0009] DieErfindung wird im folgenden detailliert beschrieben, insbesonderein ihren bevorzugten Ausführungsformen.Ferner wird sie durch den Inhalt der Patentansprüche bestimmt.
    [0010] Daserfindungsgemäße AntibiotikumHKI10311129 wird durch einen Streptomyces sp.-Stamm produziert, einem Isolat aus der "Grotta dei Cervi" in Süditalien.Dieser Stamm ist durch spezifische Merkmale charakterisiert (sieheunten).
    [0011] Aufgrundvon aufeinanderfolgenden Isolierungsschritten wurde von Streptomycessp. DSM 13059 eine Kolonie isoliert, die das Antibiotikum HKI10311129besonders effizient in der Kulturbrühe anhäuft. Ein Isolat von Streptomycessp. DSM 13059 wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH in Braunschweig, Mascheroder Weg 1B, 38124Braunschweig, Deutschland, unter der Hinterlegungs-Nr. 13059 am24.9.1999 gemäß den Bedingungendes Budapester Vertrages hinterlegt. Es kann wie folgt charakterisiertwerden: LL-DAP im Peptidoglycan, Sporenträger vom Typ S, offene Spiralen,meist kurze 34, max. 6-7 Windungen und RA-Haken, Schlingen gerade,großeSporen, keine Melaninbildung, lösl.braunes Pigment auf allen ISP-Medien, dichtes, grau versportes LuftMyzel,braun-schwarzbraunes,auf ISP 4-Medium rötlichviolettes SubstratMyzel, Wachstum und Sporulation auf allen ISP-Mediensehr gut.
    [0012] Ineinem Medium mit einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelleund üblichenMineralsalzen produziert Streptomyces sp. DSM 13059 die erfindungsgemäße VerbindungHKI10311129. Anstelle des Stammes DSM 13059 können auch dessen Variantenund Mutanten eingesetzt werden. Als Varianten und Mutanten geltenalle jene Mikroorganismen der Spezies, die in der Lage sind, dieerfindungsgemäßen Verbindungenzu synthetisieren. Solche Varianten und Mutanten können inan sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweiseBestrahlung mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder chemischeMutagene, erzeugt werden.
    [0013] DasScreening nach Mutanten und Varianten, die die erfindungsgemäße Verbindungsynthetisieren, kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität der inder KulturbrüheangehäuftenWirkstoffe, beispielsweise durch Austesten der antibiotischen Wirkungauf bekannte Testkeime anhand der dem Fachmann bekannten Methodenund durch chromatographischen Nachweis durchgeführt werden.
    [0014] Alsbevorzugte Kohlenstoffquellen fürdie aerobe Fermentation eignen sich asssimilierbare Kohlenhydrateund Zuckeralkohole, wie z.B. Glucose, Lactose, Maltose, Glycerol,Mannitol oder deren Gemische sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte,wie Malzextrakt oder Melasse.
    [0015] AlsStickstoffquellen eignen sich Aminosäuren, Peptide und Proteinesowie deren Abbauprodukte, wie Tryptone oder Peptone, ferner Fleischextrakte,gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Sojabohnenoder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung,Fischmehle oder Hefeextrakte.
    [0016] DieKultivierung erfolgt aerob, beispielsweise submers unter Schütteln oderRührenin Erlenmeyerkolben oder Fermentoren, gegebenenfalls unter Einleitenvon Luft oder Sauerstoff.
    [0017] DieFermentation kann beispielsweise in Steilbrustflaschen, Erlenmeyer-oder Rundkolben verschiedener Volumina, in Glasfermentoren oderV2A-Stahltanks durchgeführt werden.
    [0018] Siewird in einem Temperaturbereich zwischen 15 °C – 37 °C und einem pH-Wert zwischen4 und 8 durchgeführt.
    [0019] DerMikroorganismus wird unter diesen Bedingungen 3 – 6 Tage kultiviert.
    [0020] DieFermentation kann im Labormaßstab(Kulturvolumina zwischen 100 ml und 200 ml), aber auch im Produktionsmaßstab (Voluminabis mehrere m3) durchgeführt werden.
    [0021] Vorteilhafterweisekultiviert man in mehreren Stufen, d.h. zunächst werden eine oder mehrereVorkulturen in einem flüssigenNährmediumhergestellt, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, dieHauptkultur, beispielsweise im Verhältnis 1:15 – 1:20, überimpft werden.
    [0022] DieVorkultur erhältman, indem man ein versportes Myzel von z.B. Hafermehl-Nährböden in eine Nährlösung überführt, beispielsweisedurch Einimpfen von Myzel-bewachsenen Agarstücken, und diese 1 bis 2 Tageinkubiert.
    [0023] Dasversporte Myzel kann beispielsweise erhalten werden, indem man denStamm etwa 7 – 10Tage auf einem Nährboden,wie z.B. Hafermehl-Agar oder Sojamehl-Glucose-Agar, wachsen läßt.
    [0024] DasAntibiotikum HKI10311129 ist in wechselnden Anteilen in der Kulturbrühe, sowievorzugsweise im Myzel, enthalten.
    [0025] ZumTesten der Wirkstoffkonzentration im Kulturmedium oder in den einzelnenIsolierungsstufen könnendie üblichendem Fachmann vertrauten Methoden der biologischen Aktivitätsbestimmung,z.B. der Agardiffusions-Lochplattentest, angewendet werden.
    [0026] DieDetektion bei der dünnschichtchromatografischenAuftrennung kann durch verschiedene Färbeagentien (beispielsweiseVanillin-Schwefelsäure)erfolgen.
    [0027] DieIsolierung des Antibiotikums HKI10311129 aus der Kulturbrühe und demMyzel erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen,physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte.
    [0028] ZurIsolierung des Antibiotikums HKI10311129 aus submersen Kulturansätzen wirdam Ende der Fermentation Kulturmedium und Myzel getrennt und dasMyzel mit organischen Lösungsmitteln,wie Methanol oder Aceton, vorzugsweise Methanol, extrahiert.
    [0029] WeitereMengen an HKI10311129 werden durch Extraktion der vom Myzel abgetrenntenKulturlösung mitwasserunlöslichenorganischen Lösemitteln,wie z.B. Essigsäureethylester,gewonnen.
    [0030] NachEinengen der Extrakte und gegebenenfalls Reextraktion des eingeengtenMethanolextraktes des Myzels mit wasserunlöslichen organischen Lösungsmitteln,wie z.B. Essigsäureethylesteroder Dichlormethan, erfolgt die Isolierung des Antibiotikums HKI10311129unter Einsatz üblicherchromatographischer Adsorbentien bzw. Trägermaterialien, wie z.B. Kieselgeloder organophile Dextrangele.
    [0031] Durchsequentielle Anwendung der Säulenchromatografiean Kieselgel, der Gelpermeations-Chromatografiean organophilen Dextrangelen unter Verwendung von polaren organischenLösungsmitteln,wie z.B. Methanol, der Mitteldruckchromatografie an Kieselgel RP18 unter Verwendung von Acetonitril/Wasser-Gemischensowie der Hochleistungsflüssigkeitschromatografieunter Verwendung von Methanol/Wasser- und Acetonitril/Wasser-Gemischenwird schließlichreines HKI10311129 erhalten.
    [0032] Diechemische Identitätdes Antibiotikums HKI10311129 wird durch die Ergebnisse der hochauflösenden Massenspektrometrie(FAB-MS, Quadrupol-Electrospray-MS, CID-MS/MS) sowie durch hochauflösende 600MHz-Protonen- und 150 MHz-13C-NMR Korrelations-Spektroskopie, bewiesen.
    [0033] Dieantibakteriellen Wirkungen von HKI10311129 können durch die dem Fachmannbekannten Methoden, wie beispielsweise Agarplattendiffusionstestund die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) bestimmtwerden.
    [0034] HKI10311129ist gegen Bakterien, vorzugsweise gegen grampositive Bakterien wiez.B. Bacillus subtilis ATCC 6633, Staphylococcus aureus SG 511,Staphylococcus aureus 134/93 (multiresistent) und Enterococcus faecalis1528 (vanA determinierte Vancomycin-Resistenz) wirksam.
    [0035] Daserfindungsgemäße AntibiotikumHKI10311129 eignet sich aufgrund seiner sehr wertvollen, antibakteriellenEigenschaften sehr gut zur Anwendung als antimikrobiell wirksamesTherapeutikum, insbesondere in Anwendung gegen vanA-resistente Risikokeime,wie vanA-resistenteEnterokokken und mittlerweile aufgetretene, multiresistente undvanA-determinierte Vancomycin-resistente Staphylokokken.
    [0036] Daserfindungsgemäße AntibiotikumHKI10311129 kann als solches in Substanz oder als pharmazeutischeZubereitung mit geeigneten, dem Fachmann bekannten Hilfsstoffenoder Trägermaterialverabreicht werden. Die Zubereitungsformen werden in an sich bekannterWeise unter Verwendung üblicherHilfs- und Trägerstoffehergestellt, wie beispielsweise im „Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook,Hack Pub. co., N. Y., USA" beschrieben.Bei den pharmazeutischen Zubereitungsformen kann es sich um Peroralia,z.B. Tabletten, Kapseln und Dragees, um perkutane Zubereitungsformen,z.B. Salben oder Sprays, Transdermale Therapeutische Systeme (TTS)oder Gele, um intranasale Zubereitungsformen wie Nasenspray oderNasentropfen, rektale Zubereitungsformen wie Suppositorien und umParenteralia, z.B.: Implantate, Presslinge und Ampullen handeln.Die erfindungsgemäßen Arzneimittelwerden im allgemeinen oral oder parenteral appliziert, aber aucheine rektale Anwendung ist möglich.Geeignete feste oder flüssigegalenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver,Tabletten, Dragees, Suspensionen.
    [0037] Dieantimikrobiellen Eigenschaften wurden nach den US Laborstandard – Methodendes Nationalen Komitee fürKlinische Laborstandards (NCCLS) für aerob wachsende Bakterienin Flüssigmedien(National Comittee for Clinical Laboratory Standards, Methods fordilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that growaerobically, Approved Standard M7-A. NCCLS, Villanova, Pa., 1991)geprüft.Die ermittelten MHK-Werte zeigt Tabelle 3. Tabelle1: Physikochemische Eigenschaften von HKI10311129
    [0038] DieKulturlösunggemäß Beispiel1 wird durch Separieren in Myzel und Kulturfiltrat getrennt. Ersteres wirdmit Methanol extrahiert. Der Extrakt wird mit dem 4-fachen Volumenan Wasser verdünntund mit Ethylacetat extrahiert. Das Kulturfiltrat wird ebenfallsim Verhältnis2:1 (wässrigePhase zu Ethylacetat) extrahiert. Die Ethylacetatextrakte werdenvereinigt, überNatriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingeengt. ChromatographischeAufreinigung von HKI 10311129: Der verbliebene braune, ölige Rückstandwird in wenig Chloroform aufgenommen und die Lösung wird filtriert. DurchZugabe von Hexan (20-faches Volumen) wird rohes Produkt ausgefällt. Dieweitere Aufreinigung erfolgt durch Gelpermeationschromatographiean Sephadex LH-20 unter Verwendung von Methanol als Eluent.
    [0039] Dieantibakterielle Wirksamkeit aufweisende mittlere Fraktion wird vereinigtund im Vakuum zur Trockne eingeengt.
    [0040] DieFeinreinigung erfolgt durch Kieselgelchromatographie unter Verwendungeines Chloroform-Methanol-Gradienten (100:0; 95:5; 9:1). Die gelbeFraktion mit antibakterieller Wirkung wird zur Trockne eingeengt.Hochreines HKI 10311129 kann durch Chromatographie an Reversphasenkieselgelunter Verwendung eines schwach sauren Eluenten (z.B. MeCN-H2O; 83:17 und 0,05 % Trifluoressigsäure) erhaltenwerden.
    权利要求:
    Claims (4)
    [1] Verbindung (HKI10311129) mit der Molmasse 1113und der Summenformel C56H75NO22, wobei folgende Strukturformel gilt:
    [2] Arzneimittel enthaltend HKI10311129 gemäß Anspruch1 nebst üblichenTräger-und Hilfsstoffen.
    [3] Verfahren zur Herstellung von HKI10311129, das dadurchgekennzeichnet ist, daß manStreptomyces sp. DSM 13059 (HKI 0179) in einem Nährmedium kultiviert, bis sichHKI10311129 in der Kulturbrüheanhäuft undman es nachfolgend daraus isoliert.
    [4] Verwendung von HKI10311129 und Zubereitungen enthaltendHKI10311129 gemäß einemder Ansprüche1 und 2 bevorzugt zur Behandlung von bakteriellen Infektionskrankheiteninsbesondere solche verursacht durch grampositive Erreger mit Resistenzengegen gebräuchlicheAntibiotika.
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    同族专利:
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    EP1740566B1|2007-08-08|
    DE502005001193D1|2007-09-20|
    AT369352T|2007-08-15|
    DE102004010219B4|2007-02-01|
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    US20060270617A1|2006-11-30|
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    US7557091B2|2009-07-07|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    2005-09-15| OP8| Request for examination as to paragraph 44 patent law|
    2007-07-26| 8364| No opposition during term of opposition|
    2009-12-17| 8339| Ceased/non-payment of the annual fee|
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    DE102004010219A|DE102004010219B4|2004-02-27|2004-02-27|HKI10311129, neues Antibiotikum, Verfahren zu dessen Herstellung und Arzneimittel enthaltend HKI10311129|DE102004010219A| DE102004010219B4|2004-02-27|2004-02-27|HKI10311129, neues Antibiotikum, Verfahren zu dessen Herstellung und Arzneimittel enthaltend HKI10311129|
    DE502005001193T| DE502005001193D1|2004-02-27|2005-02-02|Hki10311129, neues antibiotikum, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung|
    AT05714937T| AT369352T|2004-02-27|2005-02-02|Hki10311129, neues antibiotikum, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung|
    ES05714937T| ES2292111T3|2004-02-27|2005-02-02|Hki10311129, nuevo antibiotico, procedimiento para su produccion y su uso.|
    EP05714937A| EP1740566B1|2004-02-27|2005-02-02|Hki10311129, neues antibiotikum, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung|
    PCT/DE2005/000186| WO2005082878A1|2004-02-27|2005-02-02|Hki10311129, neues antibiotikum, verfahren zu dessen herstellung und dessen verwendung|
    US11/497,953| US7557091B2|2004-02-27|2005-02-02|HKI10311129, novel antibiotic, method for producing the same and the use thereof|
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